Meios de cultura de microorganismo

 MEIOS DE CULTURA

O material nutriente preparado em laboratório para o crescimento de microrganismos é denominado meio de cultura.

O meio de cultura deve conter todos os nutrientes necessários para que o microrganismo de interesse possa crescer.

Quando microrganismos são colocados em um meio de cultura para iniciar o crescimento, são chamados de inóculo.

Os microrganismos que cresceram e se multiplicaram nos meios de cultura são denominados cultura.

Os meios de propagação e produção devem conter os nutrientes em concentrações tais que resultem em atividade máxima do agente biológico, não sendo as condições ótimas para o crescimento celular, necessariamente, as mesmas para o processo produtivo.

A escolha da fonte de carbono é muito importante devido ao fato de a síntese de diversas biomoléculas estar sujeita à repressão catabólica. 

A glicose, por exemplo, apesar de ser, em geral, excelente fonte para o crescimento celular, tem sido reportada como repressora para a síntese de diversas substâncias, em particular na produção de enzimas e antibióticos.

Conhecendo-se a composição elementar da célula, pode-se determinar a sua “fórmula mínima” e estimar estequiometricamente suas necessidades nutricionais.

Para compor um meio adequado é necessário conhecer a fisiologia dos microrganismos de estudo.

Não existe um meio de cultura universal!!!

Basicamente existe dois grandes grupos de meios de cultura:

Meios sintéticos

Meios complexos

Meios sintéticos

São os meios em que a composição química é qualitativa e quantitativamente conhecida.

Tabela 1 – Meio sintético para crescimento de Escherichia coli Componente Quantidade

Meios complexo

São meios compostos de nutrientes como extrato de levedura, de carne e peptona, que não tem composição química perfeitamente definida.

                                Meio complexo para produção de celulases por Trichoderma reesei

                                

Estado físico dos meios de cultura

Os meios de cultura podem ser sólidos ou líquidos.

Geralmente os microrganismos tem maior facilidade de iniciar o crescimento em meio líquido.

O meio sólido facilita a identificação do microrganismo e permite o cultivo de “cultura pura”.

O agente solidificador mais utilizado é o ágar, polissacarídeo extraído das algas, que funde a 100°C e solidifica ao redor de 45°C, geralmente se adiciona de 1,5 a 2,0%.

Meios Seletivos e Diferenciais

Os meios seletivos são elaborados com o objetivo de favorecer o crescimento do microrganismo de interesse e impedir o crescimento dos outros microrganismos.

O ágar sulfeto de bismuto é utilizado para o isolamento da bactéria causadora do tifo, a Salmonella typhi..

Meios diferenciais são aqueles que conferem características especiais às colônias que, em condições normais, seriam idênticas.

No meio ágar sangue, a bactéria Streptococcus pyogenes, causadoras de infecções da garganta, lisa as células sanguíneas apresentando um anel claro característicos em torno de sua colônia.

Em alguns casos, as características dos meios seletivos e diferenciais podem estar combinadas no mesmo meio de cultivo.

O meio agar sal monitol 7,5% de cloreto de sódio, é seletivo para Staphylococcus aureus, porque nesta concentração de cloreto de sódio impede o crescimento de organismos competidores e contém um indicador de pH, que altera sua cor quando o monitol é fermentado produzindo ácido.

Conservação dos microrganismos Isolado um microrganismo em cultura pura, é de interesse conservá-lo no laboratório para uso futuro.

 Semear em meio sólido distribuído em tubos e, periodicamente transferi-lo para novo meio

 Conservar em geladeira

 Recobrir a cultura com uma camada de óleo mineral

 Liofilização – os microrganismos são suspenso em meio adequado, congela a - 30°C e secagem por sublimação da água.

 Conservação em temperatura de nitrogênio líquido (-179°C).

 Solo e areia – somente para fungos.

Métodos de controle do crescimento microbiano

O crescimento celular pode ser controlado por diferentes métodos:

• Métodos físicos: Temperatura, radiação, filtração. Dessecação, remoção de oxigênio e Vibração ultrassônica.
• Métodos químicos: Desinfetantes, antissépticos preservativos usados em alimentos.

Existe uma variação muito grande em termos de sensibilidade entre os microrganismos e os endósporos dos procariotos aos métodos físicos e químicos de controle.

Métodos físicos

Os métodos físicos são muito utilizados para promover a descontaminação, a desinfecção e a esterilização. Os métodos mais utilizados para atingir estes objetivos usam como princípio o calor, as radiações e a filtração.

Temperatura: Calor seco e úmido

O calor é um dos mais importantes métodos para o controle e eliminação dos microrganismos. Acima da temperatura ideal de crescimento o calor vai promover a desnaturação de proteínas estruturais e enzimas, levando a perda da integridade celular.

O calor seco elimina os microrganismos também por processo de oxidação. O calor úmido na forma de vapor tem o maior poder de penetração e eliminar as formas vegetativas dos procarióticos, vírus e fungos e seus poros. A morte por calor é uma função exponencial que ocorre à medida que a temperatura menor será o valor D (maior temperatura, menor D). Deste modo, são necessárias rápidas exposições à temperatura alta, para grande redução no número dos microrganismos viáveis.

Métodos que empregam o calor úmido

AUTOCLAVE

Equipamento que emprega vapor d’água sob processo que produz a temperatura mínima de 121ºC. Quanto maior a pressão da autoclave mais a temperatura, estes métodos destroem as formas vegetativas e esporuladas a procariotos e fungos, promovendo a esterilização. Os príons são uma exceção por serem agentes extremamente resistentes aos métodos de desinfecção e esterilização. A autoclavação é um método muito usado em laboratórios e hospitais. Existem dois tipos de autoclaves:

• Autoclave gravitacional: o ar é removido por gravidade e sai por um ralo na parte inferior da câmera à medida que o vapor é injetado. O aquecimento é feito de fora para dentro.
• Autoclave com sistema de vácuo: o ar é previamente removido por vácuo. Quando o vapor entra penetra instantaneamente os artigos na ausência de ar residual.

PASTEURIZAÇÃO

Método muito usados na indústria de alimentos, que só podem ser submetidos ao calor em condições controlados para não desnaturar os nutrientes. Na pasteurização ocorre uma redução no número dos microrganismos pela exposição breve a uma temperatura relativamente alta.

ÁGUA EM EBULIÇÃO

É o vapor d’água livre (100ºc/20 min.). Destrói as formas vegetativas e alguns endósporos (dependendo da temperatura e da espécie de bactérias).

Métodos que empregam calor seco

ESTUFA E FORMO

Tem menor poder de penetração do que o calor úmido, usam temperatura e tempos maiores. A característica em comum entre os métodos é ausência de umidade, o que torna o processo menos eficiente e demorado.

FLAMBAGEM

Ocorre combustão completa dos microrganismos em alças e agulhas microbiológicas, as quais são aquecidas diretamente na cama do bico de Bunsen até ficarem rubras.

INCINERAÇÃO

É a combustão completa para descontaminação de material hospitalar de uso descartável (luvas, material plástico) e lixo contaminado em geral.

Baixas temperaturas

A baixa temperatura é um método de controle dos microrganismos porque causa diminuição na taxa de crescimento e na atividade enzimática. Pode não causar a morte celular. Os microrganismos patogênicos são geralmente mesofilos (não crescem a 5º C), embora existam exceções como amostras de Clostridium botulinum que crescem a 5ºC.

Métodos que empregam baixa temperatura

REFRIGERAÇÃO

Nos microrganismos comuns (0-7ºC) a taxa metabólica da maioria dos microrganismos é tão reduzida que eles não podem se reproduzir. A refrigeração comum tem mais efeito bacteriostático, entretanto, microrganismos psicrófilos crescem lentamente em baixas temperaturas, alterando o sabor dos alimentos após algum tempo, como, por exemplo, as pseudômonas. O método é usado para a preservação de alimentos durante período limitado.

CONGELAMENTO

Usado para preservar alimentos nas residências e na indústria alimentícia. As temperaturas abaixo do congelamento, obtidas rapidamente tendem a tornar os micróbios dormentes, mas não necessariamente os matam. O congelamento lento faz com que cristais de gelo se formem e cresçam rompendo as estruturas celulares e moleculares das bactérias.

Radiação não-ionizante: A radiação ultravioleta (UV) (de 4 a 400 nm – sendo 260 nm o comprimento mais eficiente) é bastante letal. Como sua maior eficiência se dá a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda onde se dá a maior absorção pelo DNA, a radiação UV afeta primariamente este tipo de molécula. Após o DNA ter sido exposto à luz UV, ocorre à formação de dímeros de timina, que impede a ação da DNA polimerase. Para exercer sua função letal sobre qualquer microrganismo, devem atingi-los diretamente, pois possuem baixo poder de penetração. Se os microrganismos estiverem complexados com matéria orgânica, isto é, fora de alcance direto dos raios (atrás de uma partícula de poeira, superfície com reentrâncias e dobras), estes permanecem vivos. Por não terem alto poder de penetração, as vestimentas e alimentos só estarão esterilizados, na superfície expostas diretamente à radiação. A água perfeitamente límpida é permeável aos raios e o vidro comum é impenetrável aos raios. O grau de exposição aos raios ultravioleta, necessários para exercer ação microbicida, depende dos fatores tempo e intensidade, que variam para os diferentes microrganismos. Bactérias ou fungos contidos no ar são facilmente atingidos pelos raios e consequentemente destruídos.

O que é radiação?

A radiação é uma forma  energia que se propagam de um meio para outro na forma de onda eletromagnética ou de partículas com ou sem carga elétrica.

Por isso essas radiações possuem inúmeras aplicações nas mais diversas áreas: industrial, médica, nuclear, pesquisa, entre outras.

Agora vamos definir de fato o que são as radiações ionizantes e não ionizantes:

Radiações ionizantes

São aquelas que possuem energia suficiente para arrancar elétrons de um átomo de um determinado meio material, formando um par de íon  positivo (átomo que perdeu um elétron) e íon negativo (elétron ejetado do átomo).

Para que esse processo ocorra a radiação incidente, precisa ter energia maior que a energia que prende o elétron na eletrosfera.

Essa energia que prende o elétron na eletrosfera  é chamada de   energia de ligação, que varia de átomo para átomo.

Cada elétron esta preso a sua camada eletrônica por um valor específico de energia medida em eV (eletron-volt). Inclusive se você quiser aprender mais sobre energia de ligação clique aqui.

Podemos citar como exemplo algums átomos presentes no nosso corpo, e suas respectivas energias de ligação dos elétrons  mais fracamente ligados,  ou seja, os elétrons que estão na última camada eletrônica, mais afastados do núcleo:

Carbono (11,3 eV)

Oxigênio (13,6 eV

Hidrogênio (13,6 eV)

Nitrogênio (14,5 eV)

Então concluindo, para que um átomo do nosso corpo seja ionizando a energia incidente precisa ser igual ou maior que as energias que estão citadas acima. Somente fótons de Raios X e Raios Gama possuem energia maior que 12 eV.

Vale reforçar que a Comissão Internacional de Proteção contra a Radiação Não Ionizante, classifica como ionizante somente aquelas radiações que possuem um comprimento de onda  menor que 10nm. As radiações que estão nesta faixa de comprimento de ondas são as radiações X e gama

• Radiações ionizantes: Raios X, Raios Gama, partículas alfa, beta, pósitrons, nêutrons etc.
• Radiações não ionizantes: Ondas de Raio e TV, micro-ondas, infravermelho, luz visível e ultravioleta.

RADIAÇÃO

As radiações constituem um método eficaz para reduzir ou eliminar os microrganismos. Existem vários tipos de radiações, eletromagnéticas como o raio x e radiações ionizantes, ultravioletas e micro-ondas.

RADIAÇÃO ULTRAVIOLETA

Esta radiação não ionizante tem sua atividade microbicida na faixa de comprimento de onda 240-280 nm, sendo 260 nm o comprimento mais efetivo para eliminar microrganismo.

Este tipo de radiação é mutagênico e leva a formação de dímeros de timina, que impedem a ação da DNA polimerase. Tem ação microbicida, mas baixo poder de penetração, por isso seu uso é recomendado apenas em superfícies (não atravessa sólidos muito pouco em líquidos). Muito eficaz na inativação dos vírus.

MICRO-ONDAS

É a radiação com os maiores comprimentos de onda do espectro eletromagnético (1nm a 1m). As frequências dos fornos de micro-ondas são sincronizadas para combinar níveis de energia em moléculas de água. No estado liquido as moléculas de águas absorvem rapidamente a energia do micro-ondas, liberando-a para alimento na forma de calor. Materiais que não contem água permanecem frios (papel, porcelana, plástico), enquanto os que a contem ficam quentes.

FILTRAÇÃO

A filtração pode ser usada para esterilizar gases e líquidos que são sensíveis ao calor. Os filtros são compostos por grande variedade de matérias sintéticos podendo ser filtros de celulose, acetado, amianto, policarbonato, teflon ou outro material sintético com poros de 0,2-0,25m. O uso da filtração é recomendado para materiais termolábeis em solução e na descontaminação do ar, em fluxos laminares e sistemas de ventilação nos quais o controle microrganismo é especialmente importante como salas de cirurgias e enfermarias de tubérculos e unidades de queimados.

DESSECAÇÃO

Os métodos que utilizam como princípio a dessecação removem a água, como os microrganismos necessitam dela para seu crescimento, estes procedimentos são eficazes para o controle do crescimento microbiano, o mais usado é a liofilização.

LIOFILIZAÇÃO

É o congelamento rápido do material sob N² e posterior remoção da água por sublimação, sendo convertida diretamente do estado solido para o gasoso. Este método bacteriostático é menos destrutivo que o congelamento. É usado na indústria de alimentos (café, leite) e na preservação de cultura bacteriana.

DEFUMAÇÃO

Consiste na diminuição do teor de água por exposição de alimento (carnes, peixes) durante horas ou dias a fumaça de madeira em combustão.

REMOÇÃO DO OXIGÊNIO

Previne o crescimento de microrganismo aeróbio. Muito usado na indústria de alimentos (café, enlatado). No caso do café, usa o empacotamento a vácuo.

VIBRAÇÃO ULTRA-SÔNICA

Consiste em vibrações sonoras de alta frequência que levam ao rompimento de células, despolimerização de compostos e quebras do DNA

Métodos Químicos

São substâncias químicas de origem natural ou sintética usadas para eliminar ou inibir o crescimento dos microrganismos. A resposta dos microrganismos aos agentes químicos varia em relação a fatores tais como pH, temperatura, presença de matéria orgânica, fase de multiplicação e mesmo presença de outros agentes químicos.

De acordo com seu efeito nos microrganismos podem apresentar:

• Efeito estático (bacteriostático, fungistático ou virustático)- inibição do crescimento. Em condições normais os microrganismos podem voltar a crescer.
• Efeito microbicida (bactericida, fungicida, viruscida) – morte do microrganismo.
• Os agentes químicos podem ser usados para descontaminação, desinfecção, anti-sepsia ou esterilização. Têm maior efeito nas células vegetativas por terem metabolismo ativo.

Método da diluição de uso

Usado atualmente, determina a concentração apropriada do desinfetante e não compara com nenhum outro desinfetante-padrão como o método do fenol.

Antissépticos

Antissépticos são agentes químicos para uso tópico em tecidos vivos. Não podem ser ingeridos. Existe teste de toxicidade que são feitos em culturas de células para verificar o nível de toxicidade.

Antisséptico se refere a tudo o que for utilizado no sentido de degradar ou inibir a proliferação de micro-organismos presentes na superfície da pele e mucosas. São substâncias usadas para desinfectar ferimentos, evitando ou reduzindo o risco de infecção por acção de bactérias ou germes.

Antisséptico é o método através do qual se impede a proliferação de micro-organismos em tecidos vivos com o uso de substâncias químicas (os antissépticos) usadas como bactericidas ou bacteriostáticos com objetivos higiênicos ou terapêuticos.

Antissépticos não devem, assim, serem confundidos com esterilizantes, que aniquilam qualquer forma de vida microbiana viável, incluindo vírus, fungos, bactérias, protozoários, endósporos e formas vegetativas. Diferem ainda dos desinfectantes, esses que destroem patógenos vegetativos e deixam de ser efetivos contra a proliferação de endósporos, agindo sobre superfícies inanimadas. Outros métodos de controle microscópico não tão comuns, e que diferem da antissepsia, podem ser ilustrados, tais como: sanitização e degerminação.Uma mesma substância química usada em objetos inanimados será chamada de desinfectante e, quando usada em tecidos vivos, será chamada de antisséptico. Exemplosː clorexidina e iodopovidona.

Índice de toxicidade (I)

É uma medida da toxicidade seletiva do antisséptico. Os testes são feitos em culturas de células e visam verificar a toxicidade do agente químico.

AGENTES QUÍMICOS

Desinfetantes e antissépticos

AGENTES ALQUILANTES

Promovem a alquilação de grupos –COOH, -OH, -SH e –NH de enzimas e ácidos nucléicos inativando-os. Em virtude da capacidade de romperem ácidos nucléicos, podem causar câncer e não devem ser usado em situações nas quais possam afetas células humanas.

GLUTARALDEÍDO

O mecanismo de ação é a alquilação (entra como subtituto) dos grupos sulfidrila, hidroxila, carbonila e grupo amino, alterando o DNA e a síntese protéica.

FORMALADÉIDO (CH20)

Pode ser um agente esterilizante ou desinfetante. Ter ação sobre Gram-positivas e negativas, fungos, vírus, microbactérias e endósporos bacterianos. Para fins de esterilização, o tempo mínimo é de 18 horas tanto em solução alcoólica a 8% como aquosa a 10%.

OXIDO DE ETILENO (ETO)

Gás incolor, com grande poder de penetração e mutagênico, o óxido de etileno é misturado com gases inertes liquefeitos como freon (difluormetano) e o CO para diminuir o risco de inflamabilidade. Os vapores do óxido etileno são tóxicos para pele, olhos e membranas mucosas, além de serem cancerígenos. Existe monitoração biológica para este tipo de esterilização. O indicador usado é o Bacillus subtilis var niger.

FENOL

O fenol (ácido carbólico) e seus derivados fenólicos são agentes desnaturantes de proteínas. Os derivados possuem alterações na estrutura do fenol que aumentam a ação antimicrobiana e diminuem a toxicidade. Por exemplo: alqui-fenois (orto, metade paracresóis).

O fenol é mais usado para desinfetar superfícies e culturas que serão descartadas. Entretanto, dependendo da sua concentração, pode ter diferentes níveis de ação:

• Fenol 0,5-1% – anti-séptico
• Fenol 5%- desinfetante

O fenol promove uma desinfecção de nível médio ou intermediário. Podem ser usados para descontaminação de superfícies hospitalares, artigos metálicos e de vidro.

BINGUANIDA

A clorexidina é um composto clorado, semelhante ao hexaclorofeno, que é eficaz contra vários micróbios, mesmo na presença de matéria orgânica. Muito usado no controle da densidade microbiana em pele e mucosas. Combinada com detergente ou álcool, também é usada para escovação cirúrgica das mãos e na preparação pré-operatória de pacientes.

HALOGÊNIOS

Hipoclorito de sódio, cloro e Iodo

CLORO E COMPOSTOS CLORADOS

Agentes oxidantes, que oxidam grupos-SH e _NH de enzimas, inibando-as e inativando ácidos nucléicos são eficazes contra vírus, bactérias gram-positivas e negativas, fungos, microbactérias, todos os tipos de vírus e endósporos.

SOLUÇÃO DE IODO

Agente químico usado com desinfetante ou anti-séptico, é um forte agente ixidante ( completa e inativa proteínas) e pode ser usado na forma de álcool ioado. Têm ação contra células vegetativas, endósporos, vários fungos e alguns vírus.

QUATERNÁRIOS DE AMÔNIO (QUATS)

São desinfetantes surfactantes, detergentes iônicos, derivados da amônia. Possuem quatro grupos orgânicos ligados a um átomo de nitrogênico do ion amônio NH+. Considerados desinfetantes de baixa toxicidade e classificados com atividade de baixo nível, é mais efetivo contra bactérias Gram-positivas do que Gram-negativas P.

PEROXIGÊNIO

Próxido de hidrogênico, áciddo peracético e ozônio

Agentes químicos oxidantes

PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

O peróxido de hidrogênico é usado como agente esterilizante na indústria de alimentos para filtros e tubulações há muito tempo, em razão de sua eficácia, passou a ser usado em outras áreas, inclusive na prática hospitalar para antisséptico. É um agente antimicrobiano eficaz, quando utilizado isoladamente.

GÁS PLASMA OU PLASMA ESTERILIZANTE DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNICO

Definido como o quarto estágio da matéria, o plasma é produzido altas temperaturas e em decorrência de um campo eletromagnético. É composto por nuvens de elétrons, íons e moléculas neutras. O sistema de esterilização utiliza o peróxido de hidrogênio como gás substrato. É um processo rápido que ocorre a baixa temperatura.

ÁCIDO PERACÉTICO

Este agente pode ser usado em baixas concentrações, possui rápida atividade contra microrganismos, procariotos, inclusive endósporos, fungos e vírus. Considerado desinfetante de níveis intermediários e altos. Decompõem-se produtos não tóxicos (água, oxigênio e peróxido de hidrogênio). É efetivo na presença de matérias orgânica.

OZÔNIO

Forma altamente reativa do oxigênio que é gerada passando o oxigênio através de descargas elétricas de alta voltagem. É frequentemente usado para suplementar o cloro na desinfecção da água. Apresenta a vantagem de ser microbicida sem contaminantes. A desvantagem é ser mais caro que o cloro, sem atividade residual.

ÁLCOOIS

Promovem a desnaturação de proteína e desorganização dos lipídeos de membrana. São indicados para desinfecção de níveis abaixo ou intermediário. Os álcoois na contração 60-90% são excelentes bactericidas, principalmente paras as formas vegetativas. Atuam também sobre células de Mycobacterium tuberculosis, alguns fungos e vírus lipofílicos. Sua indicação é para desinfecção de artigos e superfícies; e o tempo de exposição recomendado é 10 minutos.

Metais pesados

Os metais pesados usados em agentes químicos são o selênio, o mercúrio, cobre e a prata. O nitrato de prata já foi muito usado para prevenir infecções oftálmicas por gonococos em bebês na hora do parto, mas depois foi substituído por antibióticos.

Sendo de suma importância o controle do crescimento microbiano em qualquer área profissional, na fisioterapia não poderia ser diferente, a manipulação do paciente, o local de trabalho, objetos e equipamentos utilizados no tratamento de pessoas devem ser higienizados de forma adequada, a fim de evitar a propagação de micróbios existentes no meio, no profissional e até mesmo no paciente, proporcionando a descontaminação e combatendo a disseminação de doenças.